سایت مرجع دانلود پایان نامه - تحقیق - پروژه

عنوان:

نقشه یابی فیزیکی مقایسه ای ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH روی کروموزوم های گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز

اساتید راهنما:

دکتر سید حسن حافظیان

پروفسور قدرت اله رحیمی میانجی

استاد مشاور:

Prof. Leopoldo Iannuzzi

شهریور ۱۳۹۲

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)


فهرست مطالب
فصل اول. ۱
مقدمه و کلیات ۱
۱-۱ مقدمه. ۲
۱-۱-۱ گاو ۴
۱-۱-۲ گاومیش رودخانه ای ۴
۱-۱-۳ گوسفند. ۵
۱-۱-۴ بز. ۶
۱-۱-۵ اهداف ۷
۱-۲ کلیات ۷
۱-۲-۱ تاریخچه مطالعات سیتوژنتیک در دامپروری ۷
۱-۲-۲ منطق نقشه یابی ژن ها روی کروموزوم. ۸
۱-۲-۳ نقشه های لینکاژی ۹
۱-۲-۴ نقشه های فیزیکی ۹
۱-۲-۵ نقشه یابی مقایسه ای و اصلاح دام. ۱۰
۱-۲-۶ همولوژی ۱۱
۱-۲-۷ کشت سلول های خونی ۱۱
۱-۲-۷-۱ تاریخچه. ۱۱
۱-۲-۷-۲ اصول بنیادی ۱۲
۱-۲-۸ تکنیک های باندینگ (رنگ آمیزی) کروموزوم ها ۱۲
۱-۲-۸-۱ تاریخچه. ۱۲
۱-۲-۸-۲ اصول پایه ای ۱۳
۱-۲-۹- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 15
۱-۲-۹-۱ تاریخچه. ۱۵
۱-۲-۹-۲ اصول بنیادی ۱۵
۱-۲-۹-۳ استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی ۱۶
۱-۲-۹-۴ استفاده از مکان یابی فیزیکی ژن ها با تکنیک FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات ۱۷

۱-۲-۹-۵ استفاده از مکان یابی فیزیکی ژن ها با تکنیک FISH برای اتصال نقشه های لینکاژی و RH روی کروموزوم ها ۱۹
۱-۲-۹-۶ استفاده از مکان یابی فیزیکی ژن ها با تکنیک FISH در رهیافت کلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها ۲۰
۱-۲-۱۰ انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH 21
۱-۲-۱۱ ایمونوفلوروسنس. ۲۱
۱-۲-۱۲ ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیک خانواده گاو سانان. ۲۲
۱-۲-۱۲-۱ آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیک. ۲۲
۱-۲-۱۲-۲ کروموزوم های جنسی ۲۶
۱-۲-۱۳ بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 27
۱-۲-۱۳-۱ ژن برولا (FecB) 27
) 28
۱-۲-۱۳-۳ ژن BMP15 (FecX) 29
۱-۲-۱۳-۴ اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری ۳۰
فصل دوم. ۳۲
بررسی منابع. ۳۲
۲-۱ سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تکنیک FISH در حیوانات مزرعه ای ۳۳
۲-۲ سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای ۳۷
فصل سوم. ۴۰
مواد و روش ها ۴۰
۳- مواد و روش ها ۴۱
۳ – ۱  تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی ۴۱
۳ – ۱- ۱ تهیه ی نمونه های خون. ۴۱
۳ – ۱- ۲ کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های  مناسب برای FISH 41
۳-۲ انتخاب و سفارش کلون های BAC 42
۳-۲-۱ شناسایی کلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 44
۳-۲-۱-۱ ژن BMPR1B 45
۳-۲-۱-۲ ژن BMP15. 46
۳-۲-۱-۳ ژن GDF9. 47
۳-۳ کشت باکتری های حاوی کلون های BAC و استخراج DNA 48
۳-۴ نشاندارسازی DNA استخراج شده از کلون های BAC 51
۳-۵ تهیه کاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز. ۵۱
۳-۶ هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 51
۳-۷ مراحل بعد از FISH 52
۳-۷-۱ آشکار سازی سیگنال های FITC 53
۳-۷-۲ RBPI- باندینگ. ۵۳
۳-۸ بررسی میکروسکوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC 53
۳-۹ تعیین محل دقیق (باند کروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی کروموزوم ها ۵۴
فصل چهارم. ۵۵
نتایج ۵۵
۴- نتایج ۵۶
۴-۱ کیفیت DNA استخراج شده از کلون های BAC 56
۴-۲ نتایج حاصل از کشت سلولی و کاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ    ۵۶
) ۵۶
) ۵۶
) ۵۶
) ۵۷
۴-۳ جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH روی کروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه. ۵۷
) ۵۷
) ۵۷
) ۵۷
) ۵۸
۴-۴ مقایسه جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان. ۵۸
فصل پنجم. ۹۶
بحث و نتیجه گیری ۹۶
۵- بحث ۹۷
۵-۱ نقشه های ژنتیکی ۹۷
۵-۲ تفاوت های نقشه های فیزیکی و لینکاژی ۹۸
۵-۳ ژنومیکس مقایسه ای ۹۹
۵-۴ نتیجه گیری نهایی ۱۰۳
۵-۵ پیشنهادات ۱۰۳
واژه نامه. ۱۰۴
منابع و مآخذ. ۱۰۶
Abstract 121
 
فهرست جداول
جدول ۳-۱٫ مواد استفاده شده در کشت سلول های لنفوسیت خون در پژوهش حاضر. ۴۳
جدول ۳-۲٫ مشخصات کتابخانه BAC ژنوم گاوی موسسه INRA فرانسه. ۴۴
جدول ۳-۳٫ مشخصات کامل کلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر.۴۴
جدول ۳-۴٫ ترکیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA 50
جدول ۴-۱٫ جایگاه های ژنی نقشه یابی شده، کلون های BAC شناسایی شده
فهرست شکل ها
شکل ۲-۱٫  مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم. ۲۲
شکل ۳-۱٫ اطلاعات کلون  BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن BMPR1B 45
شکل ۳-۲٫ اطلاعات کلون  BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن BMPR1B. 46
شکل ۳-۳٫ اطلاعات کلون  BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن BMP15. 47
شکل ۳-۴٫ اطلاعات کلون  BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن BMP15. 48
شکل ۳-۵٫ اطلاعات کلون  BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن GDF9. 49
شکل ۳-۶٫ اطلاعات کلون  BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مکان یابی ژن GDF9. 50
شکل ۳-۷٫ مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation. 52
شکل ۴-۱٫ نتایج حاصل از استخراج DNA از کلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر. ۶۰
شکل ۴-۲٫ کاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاو (BTA) در پژوهش حاضر. ۶۱
شکل ۴-۳٫ آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو ۶۲
شکل ۴-۴٫ کاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاومیش رودخانه ای (BBU) در پژوهش حاضر. ۶۳
شکل ۴-۵٫ آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو میش رودخانه ای ۶۴
شکل ۴-۶٫ کاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر. ۶۵
شکل ۴-۷٫ آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گوسفند. ۶۶
شکل ۴-۸٫ کاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای بز (CHI) در پژوهش حاضر. ۶۷
شکل ۴-۹٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 68
شکل ۴-۱۰٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی کروموزوم شماره ۶ گاو (BTA) 69
شکل ۴-۱۱٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 70
شکل ۴-۱۲٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی کروموزوم X گاو (BTA) 71
شکل ۴-۱۳٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 72
شکل ۴-۱۴٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی کروموزوم شماره ۷ گاو (BTA) 73
شکل ۴-۱۵٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک
FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش رودخانه ای (BBU). 74
شکل ۴-۱۶٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی کروموزوم شماره ۷ گاو میش رودخانه ای (BBU) 75
شکل ۴-۱۷٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 76
شکل ۴-۱۸٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی کروموزوم X گاو میش رودخانه ای (BBU) 77
شکل ۴-۱۹٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 78
شکل ۴-۲۰٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی کروموزوم شماره ۹ گاو میش رودخانه ای (BBU) 79
شکل ۴-۲۱٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 80
شکل ۴-۲۲٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی کروموزوم شماره ۶ گوسفند (OAR) 81
شکل ۴-۲۳٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 82
شکل ۴-۲۴٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی کروموزوم X گوسفند (OAR) 83
شکل ۴-۲۵٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 84
شکل ۴-۲۶٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی کروموزوم شماره ۵ گوسفند (OAR) 85
شکل ۴-۲۷٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 86
شکل ۴-۲۸٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی کروموزوم شماره ۶ بز (CHI) 87
شکل ۴-۲۹٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 88
شکل ۴-۳۰٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی کروموزوم شماره X بز (CHI) 89
شکل ۴-۳۱٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 90
شکل ۴-۳۲٫ موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی کروموزوم شماره ۷ بز (CHI) 91
شکل ۴-۳۳٫ جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI). 92
شکل ۴-۳۴٫ جایگاه  فیزیکی ژن BMPR1B روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 93
شکل ۴-۳۵٫ جایگاه  فیزیکی ژن BMP15 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 94
شکل ۴-۳۶٫ جایگاه  فیزیکی ژن GDF9 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 95
 
چکیده
هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. هدف مطالعه حاضر مکان یابی فیزیکی مقایسه ای کلون های BAC گاوی حاوی ژن های باروری فاکتور رشد تمایز یافته ۹ (GDF9)، پروتئین ریخت زای استخوان ۱۵ (BMP15) و گیرنده نوع یک آن (BMPR1B) با بهره گرفتن از تکنیک هیبرید سازی در محل فلورسنتی (FISH) برای اولین بار روی کروموزوم های R- باندینگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو میش رودخانه ای (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. برای تهیه کروموزوم های R- باند شده با وضوح زیاد، نمونه های خون کامل از گونه های مورد مطالعه با وارد سازی دیر هنگام BrdU و Hoechst33258 کشت شدند. کلون های BAC حاوی ژن های مورد نظر از روی آخرین سازه ژنوم گاوی با توجه به گردآوری های توالی ژنوم گاوی UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسایی شده و سپس از کتابخانه BAC گاوی موسسه INRA تهیه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازی آن با روش Nick translation، اسلایدهای متافازی در حضور COT-l DNA گاوی به مدت یک شب تحت تیمار FISH قرار گرفتند. مراحل ردیابی سیگنال های FITC و تهیه متافازهای RBPI- باندینگ به ترتیب با بهره گرفتن از سیستم آنتی بادی های FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آمیزی اسلایدها با پروپیدیوم آیوداید انجام شد. تجزیه و تحلیل FISH موقعیت دقیق فیزیکی و باندهای کروموزومی مربوط به ژن های مورد مطالعه را روی متافازهای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز نشان داد. جایگاه دقیق فیزیکی ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز یکسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاومیش رودخانه ای، ژن BMPR1B روی موقعیت BBU7q21 مکان یابی شد. ژن BMP15 در گاو و گاومیش رودخانه به ترتیب روی BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعیت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مکان یابی شد. برای جایگاه GDF9، موقعیت های کروموزومی BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3  و CHI7q22.3 به ترتیب برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز شناسایی شدند. داده های حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه های سیتوژنتیک گونه های مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه های ژنتیکی روی باندهای اختصاصی کروموزومی شده و همچنین می تواند برای مطالعات ساختاری و عملکردی دقیق تر ژن های اخیر مخصوصاً در گاوسانان
مورد استفاده قرار گیرد. انتظار می رود که علاوه بر ردیابی دقیق موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، بتوان هر چه بیشتر از تکنیک های مبتنی بر سیتوژنتیک مولکولی در مطالعات مرتبط به شناسایی نواقص کروموزومی و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادی، خصوصاً صفات تولید مثلی در دام های اهلی استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسایی موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، منجر به این خواهد شد که ردیابی QTLها در حوالی این ژن ها هر چه سریع تر و با هزینه کمتر گیرد.
کلمات کلیدی: BMPR1B، BMP15، GDF9، نقشه یابی با FISH، کلون های BAC، گاو، گاومیش رودخانه، گوسفند، بز.

فصل اول

مقدمه و کلیات

۱-۱ مقدمه

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. اگر چه نقشه های ژنتیکی که تا کنون برای حیوانات اهلی تهیه شده ­اند برای ردیابی ژن ها و جایگاه های صفات کمی در فواصل ۱۰-۵ سانتی مورگان (cM) و شروع برنامه های MAS کفایت می کنند، اما شناسایی دقیق جایگاه فیزیکی ژن ها و سپس کلونینگ و ردیابی واریانس های ژنتیکی آن ها و در گام بعدی مطالعه ارتباط این واریانس ها با صفات اقتصادی در اکثر موارد به ویژه در نژادهای موجود در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران، به پژوهش های بیشتری نیاز دارند. به کارگیری داده های ژنوتیپی در ارزیابی های ژنتیکی تجاری و استراتژی های انتخاب بهینه، از جمله چالش های اصلاح نژادی می باشند که قطعاً نیازمند پیشرفت های بیشتری هستند.
کاربرد سیتوژنتیک در دام های اهلی از تکنولوژهای مفید برای توسعه ژنتیکی دام های اهلی است. سیتوژنتیک می تواند برای انتخاب حیوانات مولد فاقد نواقص کروموزومی مسئول نواقص فیزیکی (آنیوپلوئیدی)، باروری کمتر (نواقص بالانس کروموزومی) یا ناباروری (نواقص کروموزوم های جنسی) استفاده شود. همچنین سیتوژنتیک می تواند برای بررسی آلودگی های محیطی با مطالعه حیوانات موجود در مناطق آلوده و استفاده از آن ها به عنوان شناساگرهای بیولوژیکی استفاده شود (یانوزی، ۲۰۰۷).
مک کوسیک (۱۹۸۰) پیشنهاد داد که ژنوم را به عنوان بخشی از آناتومی باید مورد توجه قرار داد. آناتومی ژنوم هم از نگاه ساختاری و هم از نگاه عملکردی برای موجودات بسیار مهم است. آنالیز ژنوم گونه های اهلی ما را قادر به شناسایی و فهم مکانیسم کنترل ژنتیکی صفات مهم اقتصادی می کند. نقشه یابی ژن ها قدم اول در آنالیز ژنوم موجودات است. با در دسترس قرار گرفتن نقشه های دقیق کروموزومی و توالی های DNA، یک پژوهشگر می تواند در اکثر موارد با جستجو در بانک داده های نقشه یابی، روی یک ناحیه کاندید در ژن مورد نظر خود تمرکز کند تا اینکه ساعت ها تا ماه ها زمان را صرف فعالیت های آزمایشگاهی وقت گیر کند. با توجه به اشتباهات موجود در نقشه های لینکاژی و همچنین گردآوری های توالی ژنومی حیوانات، بهترین روش برای کاهش اشتباهات نقشه یابی ژن­ها استفاده همزمان از اطلاعات نقشه ها و توالی یابی برای تایید ترتیب ژنی در جایگاه های مورد نظر است (ویلسون و همکاران، ۲۰۰۱).